在脊椎动物胚胎发育的早期阶段，背腹轴和头尾轴的形成是决定未来组织和器官排列的重要过程，也是胚胎图式形成和形态发生的核心事件。这一过程的关键信号来自“组织中心”（Organizer）。1924年，德国胚胎学家Hans Spemann和其博士后Hilde Mangold通过经典的蝾螈胚胎移植实验首次揭示了背侧组织中心的存在[1]，Hans Spemann也因此发现获得1935年诺贝尔生理学或医学奖。随后，陆续在鸟类、小鼠和斑马鱼中发现组织中心决定胚胎体轴发育[2-4]。研究表明，组织中心通过调控细胞命运和细胞运动，引导胚层分化并逐步建立胚胎的身体轮廓，母源β-catenin信号在其中扮演着核心角色。2018年，清华大学孟安明院士和陶庆华教授课题组联合发现了背部决定因子Huluwa(Hwa)，这一蛋白通过特异性激活背侧区域的β-catenin信号通路，指导胚胎体轴的建立[5]。陈静教授当时作为共同一作，鉴定了hwa基因并阐明了主要信号转导通路。然而，随着Hwa蛋白的负向调控机制逐步被揭示，如溶酶体相关降解路径参与Hwa功能调控[6,7]，Hwa/β-catenin信号通路的激活及下游信号转导机制尚不明确。

2024年11月19日，四川大学华西医院陈静教授团队在国际学术期刊Nature Communications 上在线发表了题为 "A Huluwa phosphorylation switch regulates embryonic axis induction" 的研究论文。该研究揭示了Hwa蛋白第168位丝氨酸（Ser168）磷酸化修饰在斑马鱼胚胎体轴诱导中的关键作用，阐明了Hwa/β-catenin信号通路细胞膜上的磷酸化分子调控开关。这一发现不仅深化了对Hwa蛋白本身的理解，也为早期胚胎发育信号互作提供了新的阐述，成为陈静团队在形态发生研究中的又一重要贡献。

Hwa是一个单次跨膜蛋白，N端胞外区较短，且非体轴诱导活性所必需；C端胞内区富含结构相对松散无序区段，具有一个相对保守PPNSP基序（类似于Lrp5/6共受体的PPP(S/T)P基序）。为探究Hwa蛋白的关键功能位点，本研究首先通过对 hwa母源突变体（Mhwatsu01sm/tsu01sm）胚胎进行系列hwa突变mRNA注射。研究结果显示，注射野生型 hwa mRNA能挽救恢复突变体胚胎的体轴发育，而注射 S168A 突变mRNA不能挽救体轴发育和诱导组织中心标记基因。而该位点定位于相对保守的PPNSP基序中，不同物种中Hwa 同源蛋白对应位点突变均显示出功能缺失，表明该位点在进化中具有保守性（图1）。在机制上，缺失或突变Ser168位点降低了Hwa与Tankyrase 1/2的结合亲和力，使Axin蛋白的降解受阻，从而阻碍了下游β-catenin信号通路的激活。

随后，研究团队利用 LC-MS/MS 技术鉴定了 Hwa 蛋白的Ser168 位点在斑马鱼胚胎和HEK293T 细胞中均存在磷酸化修饰，并发现多种激酶，如Cdk16、Cdk2和GSK3β等在体内（in vivo）和体外（in vitro）都能增强Ser168的磷酸化（图2）。激酶共表达将增强Hwa的轴诱导活性，而显性负效应Cdk16DN和pHwa(Ser168)抗体处理则会抑制Hwa蛋白的体轴诱导活性，这进一步证明了该位点磷酸化修饰在体轴诱导中的关键作用。

最后，通过CRISPR/Cas9结合ssDNA donor定点编辑技术获得单碱基编辑的MhwaS168A/S168A突变体模型，表型显示该突变导致胚胎丧失胚轴形成能力，与Mhwatsu01sm/tsu01sm的完全功能缺失表型一致。与此同时，通过与hwa基因表达缺失突变体hwatsu01sm进行杂交获得的复合杂合胚胎（MhwaS168A/tsu01sm），也呈现体轴完全缺失表型，这些内源性的遗传证据表明Ser168对斑马鱼胚胎体轴的形成至关重要（图3）。综合以上实验结果，该研究提出了Hwa/β-catenin信号通路的磷酸化分子开关模型（图4），Hwa蛋白的磷酸化开关可能由多激酶参与调控，以保障胚胎体轴发育的稳健性。

正值“组织中心”发现100周年之际，该研究发现了Organizer关键调控因子Hwa的磷酸化分子开关，为我们对Organizer的理解提供了进一步的认识，该工作的发表也是对Organizer世纪纪念的献礼致敬。展望未来，研究团队认为Hwa蛋白磷酸化分子开关可能是一种普遍机制，为探究体轴诱导中的重要调控因子，以及细胞命运决定、发育稳健性和发育冗余信号通路之间的相互作用提供了新的契机。

四川大学华西医院/华西临床医学院陈静教授为通讯作者，其研究生李瑶、严芸，以及康奈尔大学威尔医学院的青年学者龚波为共同第一作者。四川大学华西医院小儿外科研究室郑倩文、周海燕、孙佳睿、李明澎、王照、李垚辉、万芸婧、陈韦西等参与了该研究工作，清华大学孟安明教授、陶庆华教授、沈炜敏博士，北京大学朱薛辰教授，厦门大学李光教授，四川大学莫显明教授、戚世乾教授和向波教授等对本研究提供了重要的帮助或建议。文中构建的斑马鱼品系将保藏至国家水生生物种质资源库国家斑马鱼资源中心。

参考文献：

1. Spemann H, Mangold H. The induction of embryonic predispositions by implantation of organizers foreign to the species. Arch Mikrosk Anat En 1924; 100:599-638.2 Waddington CH. Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick. J Exp Biol 1933; 10:38-U34.3 Beddington RS. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development 1994; 120:613-620.4 Shih J, Fraser SE. Characterizing the zebrafish organizer: microsurgical analysis at the early-shield stage. Development 1996; 122:1313-1322.5 Yan L, Chen J, Zhu X, Sun J, Wu X, Shen W, Zhang W, Tao Q, Meng A. Maternal Huluwa dictates the embryonic body axis through β-catenin in vertebrates. Science 2018; 362(6417):eaat1045.6 Zhu X, Wang P, Wei J, Li Y, Zhai J, Zheng T, Tao Q. Lysosomal degradation of the maternal dorsal determinant Hwa safeguards dorsal body axis formation. EMBO Rep. 2021; 22(12):e53185.7 Tejeda-Muñoz N, De Robertis EM. Lysosomes are required for early dorsal signaling in the Xenopus embryo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2022; 119(17):e2201008119.